流式細(xì)胞檢測(cè)-細(xì)胞-南京英瀚斯

成纖維細(xì)胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開(kāi)，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告，用另外- -組剪刀、鑷子剪開(kāi)腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有d-pbs的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml d-pbs的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，單細(xì)胞測(cè)序，倒掉d-pbs，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許d-pbs，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有d-pbs的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。

3. 用200 μ的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4c 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37c水浴中-30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分-。

4.將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml mef生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml mef生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml mef生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。

6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml mef生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時(shí)后更換新鮮的mef生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長(zhǎng)滿后，先用d-pbs沖洗，倒掉后加胰酶-(此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者- -般不超過(guò)五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右， 將其-后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。